微生物限度檢查中的一些常見問題解答

1、問: 做無菌驗時陽性對照菌是怎么加入的?可以在加完培養(yǎng)基后用無菌的器把菌液注入嗎?
答:嚴(yán)格的說是要在最后一遍沖洗液中加入陽性對照菌的,這主要是考量濾膜對于陽性菌的截留性～但是濾器如果可以提供濾膜對于陽性菌的充分截留的話在最后的培養(yǎng)體系中加入陽性菌也是未嘗不可的. 如果供試品沒有抑菌作用,可以在加完培養(yǎng)基后用無菌的器把菌液注入,搖勻如果供試品有抑菌作用,正如安哥洛卡所講,在最后一次沖洗液中加入陽性對照菌,搖勻,抽慮,加培養(yǎng)基. 無菌檢查，加入陽性的方法可以有許多種，可以根據(jù)個人的習(xí)慣。只是注意：1、避免人為污染。2、陽性菌加入數(shù)量，關(guān)鍵詞:陽性對照菌
2、問: 離心沉淀法的原理、操作和注意事項是什么?
答:原理:利用沉降系數(shù)的差異將供試品和微生物進(jìn)行分離;
操作:取規(guī)定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘(供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取全部上清液再離心)，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋劑至原規(guī)定量.
注意事項:由于沉降系數(shù)比較小, 500r/min離心5min，黑曲霉、白色回收率為20%,因此其檢查不適宜用低速離心沉淀法.
關(guān)鍵詞:離心沉淀法
3、問: 穩(wěn)定性實驗的微生物及無菌檢查,是否每次都要做?
答:是;
原因: 一 實驗期內(nèi)可能會染菌;
二 后微生物并不是就徹底死亡,有些成為碎片,這些碎片在一定的條件和時間下,可以自我修復(fù)而復(fù)活.
三 穩(wěn)定性的考察，也應(yīng)包括有效期的考察，在此期間所有的項目都應(yīng)是合格的，無菌也是其中之一，如果在有效期內(nèi)無菌不合格，也可以說明該藥品存在一定的缺陷，至少，有效期有問題。
關(guān)鍵詞: 穩(wěn)定性實驗
4、問:眼部給制劑如何做衛(wèi)生學(xué)檢驗?
答:液體制劑:無菌檢查;
半固體及固體制劑:微生物限度檢查
關(guān)鍵詞: 眼部給制劑
5、問:滴眼液的微生物限度為何進(jìn)行無菌檢查?
答: 一 滴眼劑產(chǎn)品系按照無菌工藝生產(chǎn)且終產(chǎn)品為產(chǎn)品,故其成品的微生物質(zhì)量應(yīng)要求統(tǒng)一為無菌;所以,滴眼劑產(chǎn)品的臨床合理用藥應(yīng)與其衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求一致,即將其微生物質(zhì)量要求統(tǒng)一為無菌,顯然較為合理;
二 滴眼劑的微生物質(zhì)量要求為無菌,是與各國典在滴眼劑要求上的統(tǒng)一,及對《中國藥典》此項規(guī)定合理性的及完善等方面看,滴眼劑成品的微生物質(zhì)量要求統(tǒng)一為無菌具有必要性。
三 同時,中國已加入wto,進(jìn)出口藥品已有明確質(zhì)量要求(在國外藥典中,眼用藥品都以無菌要求),同時臨床用藥較加合理與規(guī)范。
故現(xiàn)行典將滴眼劑的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一為強制性無菌要求。
關(guān)鍵詞: 滴眼液 無菌檢查
6、問:如何進(jìn)行驗證?
答: 可用生物指示劑進(jìn)行驗證,
濕熱:濕熱脂肪芽孢桿菌孢子
干熱:枯草芽孢桿菌孢子
7、問:為凈度沉降菌的檢查只用營養(yǎng)瓊脂?
答:一 玫瑰紅鈉培養(yǎng)基對的生長有抑制作用,而營養(yǎng)瓊脂對于的生長則沒有抑制作用,所以選用營養(yǎng)瓊脂作為培養(yǎng)基
二 營養(yǎng)瓊脂主要為培養(yǎng),而且培養(yǎng)時間是2天,原因為為原核生物,生長與繁殖的能力較霉菌等真核生物強,所以控制了,霉菌等也在一定程度上也得到了控制
三 廠家在制定自己的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)時,可以同時對和進(jìn)行控制.
關(guān)鍵詞:沉降菌
8、問: 微生物培養(yǎng)時間范圍如何界定?
答: 含量測定所允許的誤差為±2%,如果照此限度,無菌培養(yǎng)時間為14天*24小時/天=336小時,它的2%為6.72小時,前后共13.44小時;又加上無菌檢驗沒有必要達(dá)到含量測定所要求的精度,所以我們完全可以在培養(yǎng)的*十四天的任何上班時間觀察結(jié)果下結(jié)論.微生物限度檢查培養(yǎng)時間分別為48小時及72小時, 它們的2%分別為0.96小時,1.44小時,即我們只能在準(zhǔn)確培養(yǎng)時間的前后1~2小時內(nèi)計數(shù).
關(guān)鍵詞: 微生物培養(yǎng)時間
9、問：乳膏，需加聚山梨酯80、司盤、單硬脂酸甘油酯乳化，后離心集菌(離心后不分層)，再薄膜過濾。但基質(zhì)堵住膜孔，過濾速度非常慢，怎么辦?
答：1、可以用十六烷酸異丙酯萃取基質(zhì)，使之分層，取水層進(jìn)行薄膜過濾(回收率差)。
2、樣品加入吐溫-80，乳化(45度)-----薄膜過濾。
關(guān)鍵詞：乳膏、十六烷酸異丙酯、萃取、吐溫-80、乳化(45度)、薄膜過濾
10、問:陶瓦蓋作用及使用范圍
答:陶瓦蓋的主要作用為防止菌落蔓延生長成片或發(fā)生重疊影響計數(shù),通常在在效價測定中使用,在微生物限度檢查中僅在易形成片狀菌某些劑型如蜜丸、水丸中使用.
關(guān)鍵詞:陶瓦蓋
11、問:如何根據(jù)物品的特性確定合格的時間和溫度?
答:一般情況下，含有糖分的培養(yǎng)基溫度需控制在115℃15～20min，不含糖分的培養(yǎng)基溫度控制在121℃15～20min，而含菌的培養(yǎng)基(使用過)溫度需控制在121℃30min左右 ，此外每次使用時，應(yīng)放入必要的監(jiān)視指標(biāo)。
關(guān)鍵詞:時間 溫度
12、問:如何減少培養(yǎng)基靈敏度下降引起的誤差? 答:目前大多數(shù)單位使用干粉培養(yǎng)基，使用較方便，但由于其較易吸潮，如存放不當(dāng)出現(xiàn)凝塊，則其凝固性較差，應(yīng)避免使用。新鮮配制的培養(yǎng)基應(yīng)在2℃～20℃避光保存，但不得凍結(jié)，保存時間不得過2周。硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基儲存過程中，若氧化還原層**過1/5，須經(jīng)水浴加熱煮沸10min方可使用，但只限一次。否則可使培養(yǎng)基中糖、微生 物和氨基酸受到破壞，影響質(zhì)量
關(guān)鍵詞:培養(yǎng)基靈敏度
13、問:如何控制的培養(yǎng)時間?
答:不同的培養(yǎng)時間對樣品總數(shù)計數(shù)結(jié)果的影響 樣品經(jīng)24h培養(yǎng)后，有的菌落很小，漏掉，培養(yǎng)48h后，菌落不但變大，而且還有很多新生長出來的菌落，培養(yǎng)72h后，菌落數(shù)增加不多，但菌落明顯變大，而且混雜的霉菌生長旺盛，影響結(jié)果的觀察計數(shù)。同時這也是一些樣品經(jīng)72h培養(yǎng)后總數(shù)技術(shù)有明顯增加的一個原因。培養(yǎng)24h和培養(yǎng)48h計數(shù)結(jié)果有明顯差異，后者合格率明顯降低，所以在規(guī)定的培養(yǎng)環(huán)境下，應(yīng)嚴(yán)格遵守培養(yǎng)時間，以便真實的反映出樣品中總數(shù)的水平。
關(guān)鍵詞: 培養(yǎng)時間
14、問:菌種保藏與管理應(yīng)執(zhí)行哪些程序?
答:菌種保藏與管理應(yīng)有完整的程序，保藏的菌種必須具備該菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)資料。一般是首先填寫菌種卡片，登記菌種名稱編號，來源歷史，形態(tài)特征，生化與學(xué)鑒定，以及菌種傳代次數(shù)、較宜培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件、保藏方法、貯存條件及保藏地址等
關(guān)鍵詞:菌種保藏與管理
15、問:青霉素酶的保存條件及溫度對其活性的影響
答:青霉素酶能夠在4℃保存6 個月以上活性不發(fā)生顯著改變。與同時采用的加入甘油或增加氯化鈉濃度保護(hù)酶活性的方法比較, 沒有顯著的不同;
溫度對青霉素酶的活性影響很大。55 ℃時對青霉素g呈現(xiàn)較高水解活性, 隨著溫度的升高或降低, 酶水解活性逐漸下降。緩沖液ph 對酶活性存在一定的影響, 較適酸堿度為 ph 7.0 ,在應(yīng)用本酶進(jìn)行青霉素制劑無菌檢查等應(yīng)用時, 需特別注意測試溫度及酸堿度的影響.
關(guān)鍵詞:青霉素酶 保存
16、問：標(biāo)準(zhǔn)時間
按f0=ft * 10(t-121)/10計算，f0要大于8，在160--170度是短時間就能做到的，為什么干熱要兩小時以上呢?
答：濕熱和干熱的效果是不同的， 飽和蒸汽的穿透性比干熱空氣穿透強得多,蒸汽冷凝時放出的潛熱傳給待品,使之升溫并使待品所帶的微生物尤其是表面的微生物發(fā)生水合作用, 從而加速了它們的死亡。所以在達(dá)到同樣效果的前提下,濕熱所需要的時間要短得多。
(公式 f0=ft * 10(t-121)/10 只適合于濕熱 ,f0系t=121℃及z=10℃下的ft值。如果把121℃理解為“標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)”,那么f0可理解為“標(biāo)準(zhǔn)值”)
關(guān)鍵詞：時間、濕熱、干熱
17、問：驗證是不是要3批樣品的一次，還是一批樣品的3次，還是3次樣品3次得實驗?
答：1、驗證的目的，是要考察實驗方法的可行性(避免出現(xiàn)陽性、陰性)，
2、在樣品的藥物組成、成份、給藥途徑一致的前提下，驗證時，“同一個批號的做3次”或“3個批號的各做一次”，均可。
關(guān)鍵詞：驗證、3次、1次
18、問：做實驗的好習(xí)慣是什么?
答：1.實驗前后清潔洗手，完畢清理實驗現(xiàn)場，器皿洗凈歸原，儀器等電源關(guān)閉。 2.試劑、樣品標(biāo)簽詳細(xì)準(zhǔn)確，包括劑量，規(guī)格，時間，實驗人員等等;實驗記錄詳細(xì)準(zhǔn)確，以便備查和分析。 3.提前分析實驗內(nèi)容及步驟，準(zhǔn)備好全部的試劑及相應(yīng)工具、儀器，不懂或者有疑問的步驟和地方問清楚，重點難點重點標(biāo)出，做到心中有數(shù);實驗完畢及時分析。 4.科學(xué)計劃、合理分配時間，做到忙而不亂。實驗中仔細(xì)觀察試驗過程，及時記錄可疑或者需要注意的地方。 5.多讀文獻(xiàn)多與別人交流，開拓思路，改進(jìn)方案，對于實驗的進(jìn)展及方向做到一定的把握。
關(guān)鍵詞：做實驗、好習(xí)慣
19、問：限度檢查所用器皿用自來水洗后一定用純化水再洗嗎?
答：gmp認(rèn)證中關(guān)于qc的規(guī)程中分析用玻璃器皿清潔規(guī)程要求如下
1.0目的 提供玻璃器皿的清潔方法的文件指導(dǎo)。 2.0范圍 化驗室部門所有玻璃器皿。 3.0責(zé)任 化驗室人員。 4.0程序 4.1 玻璃器皿每次使用后，使用者必須使其清潔并放于固定位置備用。 4.2 一般玻璃器皿清潔，用飲用水或去污劑洗滌后，器壁應(yīng)不掛水珠，再用少量純化水沖洗器皿三次，放固定位置自然干燥。 4.3 定量分析用玻璃器皿(如滴定管;移液管等)清潔，先把器皿內(nèi)的水瀝掉，然后往其中加入洗液，浸泡一段時間，放掉洗液，用飲用水沖洗后，再用純化水沖洗三次，倒置自然干燥。 4.4 水分測定用的玻璃器皿清潔過程同1或2，清潔后置于105~107℃烘箱內(nèi)烘干。然后存放于干燥器中。
關(guān)鍵詞：限度檢查、器皿、純化水
20、問：潔凈室甲醛氣體熏蒸驗證方案是什么?
答：1、 甲醛方法
在所有的液中甲醛較常用。當(dāng)相對濕度在65%以上、溫度在24~40℃時，甲醛氣體的效果較好，但若采用過多的甲醛，會因聚合而析出白色粉未附在物或設(shè)備表面。一般甲醛的方法如下：
a：前先用絲綢浸用水(純化水)擦洗房間建筑物和設(shè)備表面，然后用5%香草酚溶液噴酒或擦洗，靜置1小時后，再用絲綢浸用水(純化水)擦洗一次。
b：計算體積(包括房間及風(fēng)管體積)，按10ml/m3的比例準(zhǔn)備濃度為36%的甲醛溶液(甲醛密度為1.1g/ml)，按2~3g/m3的比例準(zhǔn)備溶液。
c：在房間中放入試驗裝置，如不銹鋼培養(yǎng)皿支架;直徑90mm雙碟玻璃培養(yǎng)皿;枯草桿菌試紙，每張試紙上枯草桿菌數(shù)量為1*106個，每個培養(yǎng)皿中放2張試紙，1張做無菌試驗，1張做含菌數(shù)試驗。培養(yǎng)皿的數(shù)量應(yīng)根據(jù)房間面積確定。
d：流程：在不銹鋼容器中加入，用雙層紗布蓋住桶口，再倒入36%濃度的甲醛溶液 甲醛氣體擴散(約30min) 啟動空調(diào)器讓甲醛氣體循環(huán)(約20min) 關(guān)閉通風(fēng)系統(tǒng)，房間熏蒸，不少于7hr 房間排氣，用新鮮空氣置換(約2hr) 開啟空調(diào)系統(tǒng) 用75%酒精噴酒環(huán)境。
e：質(zhì)監(jiān)部門取樣培養(yǎng)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：試紙內(nèi)枯草桿菌數(shù)量小于1*103個為合格。
f：取樣后用絲綢沾0.1%的新潔爾滅溶液擦洗機器表面;用0.1%新潔爾滅溶液或1%germ warfare溶液或75%酒精噴灑建筑物四周。0.1%新潔爾溶液與1%germ warfare溶液溶液每月輪換一次。
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